B2 原理:水样中的菌经过滤膜或离心浓缩,为减少杂菌生长,浓缩样品的一部分经酸处理与加热处理,一部分不作处理,将上述处理与未处理样品分别接种BCYE琼脂平板并进行培养,在选择性培养基上生成典型菌落则认为是军团菌。
B3 主要仪器设备:
B3.1 平皿:90-100mm
B3.2 培养箱:35或37±0.5℃
B3.3 紫外光灯:波长360±2nm
B3.4 滤膜滤器:可装直径45mm滤膜
B3.5 滤膜:孔径、0.22~0.45μm
B3.6 蠕动泵
B3.7 离心机
B3.8 涡旋振荡器:可达200rpm以上
B3.9 显微镜、荧光显微镜、体式镜
B4 采样:
B4.1 采样容器:玻璃瓶或聚乙烯瓶,用前灭菌。沉积物与软泥需要广口瓶,不管什么容器均需螺口或磨口。
B4.2 采样量:每个采样点取水样100-200mL。
B4.3 中和余氯:采样容器灭菌前加入少许硫代硫酸钠溶液以中和水样中的剩余氯。
B4.4 样品运输与贮存:样品最好2天内送达实验室,不必冷冻,但要闭光和防止受热,室温下贮存不得超过15天。
B5 样品处置:如有杂质可静置沉淀或1000r/min离心1min去除。
B6 方法与步骤:
B6.1 水样的滤膜过滤:将预处理过的水样通过孔径、0.22~0.45μm滤膜过滤,取下滤膜置于15mL水样中,充分洗脱。将洗脱的样品分成三份,一份作热处理,一份作酸处理,一份不处理。
B6.2 水样的热处理:取1±0.5mL洗脱样品置50±1℃水浴30±5min。
B6.3 水样的酸处理:取5mL洗脱样品加同等量1.2mol/L酸缓冲剂,调PH2.2±0.2,轻轻摇允,放置5min。
B6.4 接种与培养:各取0.1mL上述三种处理好的样品,分别接种GVPC平板。接种过的平板静止放置,观察到有培养物时,反转平板置35或37±0.5℃孵育10天。注意保湿。
B6.5 观察结果:军团菌生长缓慢,易于被其它菌淹盖,故需每天在体式镜上观察。军团菌的菌落颜色多样,通常呈白色、灰色、蓝色或紫色,也能显深褐色、灰绿色、深红色。菌落整齐,表面光滑,呈典型毛玻璃状,在紫外光灯下,有荧光。
B6.6 菌落验证:从每一个平皿上选2个可疑菌落,接种BCYE和L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板进行传代培养,35或37±0.5℃培养2天,凡在BCYE培养基上生长而在不含L-半光氨酸的BCYE琼脂平板不生长的即为军团菌菌落。