虽然多种哺乳动物和禽类的红细胞均能被流感病毒凝集，但目前应用最广的是豚鼠、鸡和人“O”型的红细胞。
“O”相毒株是指只能在鸡胚羊膜腔或敏感细胞中生长，感染的羊水或细胞维持液只凝集人或豚鼠的红细胞，而几乎不凝集鸡的红细胞的流感毒株。这种毒株在鸡胚尿囊腔适应传代后，获得了在鸡胚尿囊腔复制的能力，同时还获得了对鸡红细胞凝集能力与人及豚鼠的一样好，这种生物学特性发生改变的病毒为“D”相毒株。
流感病毒能从凝集的红细胞表面释放下来，释放下来的病毒还能凝集新的红细胞，而被凝集和释放后的红细胞不能再被相同的病毒颗粒所凝集。
于病毒悬液中加入特异性的抗流感病毒HA蛋白的抗血清，能抑制红细胞凝集现象出现，即为红细胞凝集抑制实验。
目前，红细胞凝集和凝集抑制实验为流感各方面工作中应用最广泛的一种技术。
C2 实验器材
C2．1 大孔或小孔塑料板
C2．2 10ml或1ml或1000ul和200ul或多排吸管
C2．3 200ul和1000ul吸头
C3 试剂
C3．1 0.85%无菌生理盐水
C3．2 Alsever氏液
葡萄糖 2.08g
柠檬酸钠 0.80 g
柠檬酸 0.055 g
NaCl 0.42g
加蒸馏水至 100ml
8磅20分钟高压灭菌，置4℃备用。
C3．3 1%红细胞悬液
以鸡红细胞为例：于10或20ml注射器中先吸入约3ml阿氏液（Alsever's Solution），然后从鸡翅静脉或心脏采集，用生理盐水洗涤3次，前2次1500r/min离心5min，最后1次同速度离心10min， 弃上清，用无菌生理盐水配成1%悬液，置4℃待用。一般置4℃能保存7天左右，一旦发生溶血应弃掉。
C3．4 受体破坏酶（RDE）
C3．5 免疫血清或测定血清
C4 红细胞凝集实验
C4．1 操作步骤
C4．1．1 取一干净的大孔塑料板，标记所要测定的标本名称
C4．1．2 于第一孔加入0.25ml（1：2开始稀释）或0.4ml（1：5开始稀释），从第二孔开始一律各加0.25ml0.85%生理盐水。
C4．1．3 如1：2开始稀释，于第一孔中加入0.25ml病毒悬液；如1：5开始稀释，于第一孔中加入0.1ml病毒悬液。用吸管吹打，使充分混匀，吸出0.25ml至第二孔，依次类推作倍比稀释，直至最后一孔，吹打后吸出0.25ml弃掉。
C4．1．4 于每孔中加入0.25ml生理盐水，然后再加入0.25ml1%红细胞悬液。相混后置室温或4℃ 30－60min，而后观察结果。
注：如采用微量法，应用小孔塑料板和稀释枪，总量为75ul（病毒25ul，25ul生理盐水和红细胞悬液25ul），其余同常量法。
C4．2 观察结果
结果以++++、+++、++、+、±和— 表示之。
一层红细胞均匀地铺于孔上者为++++。
基本同上，但边缘不整齐，铺的面积稍小些者为+++。
红细胞形成一个环状，四周有小凝集块者为++。
红细胞形成一个小团，但边缘不光滑，四周有小凝块者为+。
红细胞于孔底形成一个小团，边缘光滑并有立体感，将板倾斜片刻，就可见红细胞滑动象人的眼泪滴样者为—。但用豚鼠或人“O”型红细胞时常见不到孔底形成一个小团和眼泪滴样结果出现。
“±”即为可疑，计算时以“—”（阴性）处理。
C4．3 红细胞凝集滴度计算
结果以++为终点，亦即一个凝集单位。也就是说最高稀释度病毒能引起++号的红细胞凝集为终点，此稀释度的倒数为红细胞凝集滴度，简称血凝滴度。
下面以表1为例，进行计算。
表1 红细胞凝集单位计算
┌─┬────────────────────────────────┬────┬───┐
│标│ 病毒 稀释度 │ 滴度 │备注 │
│本│ │ │ │
│号│ │ │ │
├─┼───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬────┼────┼───┤
│ │ 1：10│ 1：20│ 1：40│1：80 │1：160│1：320│1：640│1：1280 │ │ │
│1 │ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ —│ — │ 480 │ │
│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │取均数│
│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
├─┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼───┤
│2 │ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ + │ — │ 560 │ 小1/8│
│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
├─┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼───┤
│3 │ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ ++│ — │ 640 │不必算│
│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
├─┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼───┤
│4 │ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ +++│ — │ 800 │ 大1/4│
│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
├─┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼───┤
│5 │ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ +++│ +++│ — │ 640 │先整 │
│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │后算 │
├─┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼───┤
│6 │ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ ++++ │＞1280或│ │
│ │ │ │ │ │ │ │ │ │≥1920 │ │
├─┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼───┤
│7 │ — │ —│ —│ —│ —│ —│ —│ — │ ＜10或│ │
│ │ │ │ │ │ │ │ │ │≤7.5 │ │
└─┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴────┴────┴───┘
口决：
1．先整后算。表1中，1－4，6和7不必进行整理，而5中，必须将1：640处一个加号挪到1：320处为4个加号，而1：160处变成两个加号，然后再进行计算。
2．两个加号不用算。如表1中的3，滴度为640。
3．小，小本身的1/8。如表1中的2，1：640处仅一个加号，故血凝滴度一定小于640，应为640－640/8=560。
4．大，大本身的1/4。同理4中血凝滴度一定大于640，应为640+640/4=800。
5．两个极端取中间。如1，1：320为4个加号，1：640为阴性，应为（320+640）/2=480。
C5 红细胞凝集抑制实验
C5．1 操作步骤
C5．1．1 血清中非特异抑制素的去除
受体破坏酶（RDE）处理法：1容量血清，加4容量RDE，37℃水浴16－18h，然后，置56℃水浴50min(以破坏残余的RDE活性)；置4℃保存待用，勿冻存。经此法处理的人、鸡和山羊血清对甲、乙型流感病毒的非特异性抑制素均可完全去除。RDE处理对特异性抗体无影响。但有时经处理的血清对测定的红细胞有非特异性凝集。如发现时应在处理后血清中加入终浓度为20%的浓的测定用红细胞，摇匀，置室温60min或4℃过夜，1000r/min离心5min，收存上清。对人血清抗体测定时，一般均经此步处理。
C5．1．2 四个血凝单位抗原的制备
四个血凝单位计算：将血凝单位除以4，如表1中标本1，它的四个血凝单位应为：480/4=120，即将标本1进行1：120稀释时，其稀释液就是含四个血凝单位。配成后必须进行复核测定：取一块干净的大孔塑料板，在前三孔，也可任意连续的三孔，每孔加入0.25ml生理盐水，用一根1ml的吸管，取0.25ml四个血凝单位的抗原放入第一孔，倍比稀释至第三孔，吸出0.25ml弃之，然后每孔加入0.25ml生理盐水，再加入0.25ml1%红细胞悬液，摇匀，置室温30—60min后，观察结果。正确结果，应第一孔出现++++，第二孔++，第三孔阴性或+。如太大或太小都得重新配置。复核测定合格后，置4℃或冰上，当天使用。
C5．1．3 血抑测定
C5．1．3．1 取一干净的塑料板，标明测定血清标本，最后一孔为血清对照孔。
C5．1．3．2 每孔加入0.25ml生理盐水。
C5．1．3．3 于第一孔和最后一孔中各加入0.25ml经RDE处理过的血清，从第一孔起作倍比稀释至倒数第二孔，弃掉0.25ml。
C5．1．3．4 将最后一孔轻轻吹打后，亦弃掉0.25ml。
C5．1．3．5 于最后一孔加入0.25ml生理盐水，其余各孔一律加入0.25ml四个凝集单位抗原，轻轻摇匀，置室温60min。
C5．1．3．6 各孔加入0.25ml1%的红细胞悬液，摇匀置室温30－60min后观察结果。
C5．1．3．7 对照组
血清对照 血清0.25ml+生理盐水0.25ml
血凝素对照 分别加入4，2，1，1/2单位血凝素0.25ml+生理盐水0.25ml
红细胞对照 加生理盐水0.5ml
以上各对照组再分别加入1%的红细胞悬液0.25ml，摇匀，在同等条件下观察结果。
C5．2 结果判断
血凝的记录同血凝测定法，以能完全抑制红细胞凝集（简称血抑）的最高血清稀释度的倒数为血清抗体效价，即终点。以表2为例，加以说明。
表2 血抑测定结果
┌─┬───────────────────────────────────┬─────┐
│血│ 血清稀释度 │ 效价 │
│清├───┬───┬───┬───┬────┬────┬────┬────┤ │
│号│1：10 │ 1：20│ 1：40│ 1：80│ 1：160 │ 1：320 │ 1：640 │ 1：1280│ │
├─┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼─────┤
│1 │ — │ —│ —│ —│ — │ — │ ++++ │ ++++ │ 320 │
├─┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼─────┤
│2 │ — │ —│ —│ —│ — │ + │ ++++ │ ++++ │ 280 │
├─┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼─────┤
│3 │ — │ —│ —│ —│ — │ ++ │ ++++ │ ++++ │ 240 │
├─┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼─────┤
│4 │ — │ —│ —│ —│ — │ +++ │ ++++ │ ++++ │ 200 │
├─┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼─────┤
│5 │ — │ —│ —│ —│ — │ ++++│ ++++ │ ++++ │ 160 │
├─┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼─────┤
│6 │ — │ —│ —│ —│ — │ + │ +++ │ ++++ │ 320 │
├─┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼─────┤
│7 │ — │ —│ —│ —│ — │ — │ — │ — │ ≥1280 │
├─┼───┼───┼───┼───┼────┼────┼────┼────┼─────┤
│8 │ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ ++++│ ++++ │ ++++ │ ＜10或≤5│
└─┴───┴───┴───┴───┴────┴────┴────┴────┴─────┘
同样在计算抗体效价之前，应对结果进行整理，方法同前。如6中，必须把1：320处的一个加号移到1：640处，使1：320处变成“—”，而1：640处变成“++++”。
根据公式进行计算：X=Y+Y/4×Z
X：血清效价
Y：能引起血凝全抑制最高血清稀释度的倒数
Z：4减去不能被抑制数（全抑制高一个稀释度）
例如：2号血清效价：X=Y+Y/4×Z=160+160/4×（4－1）=280
C5．3 交叉血抑测定和抗原比计算
为了确切了解抗原性变异的幅度，常用交叉血抑测定进行抗原分析。测定中所用的免疫血清包括既往流行过的代表株和用新分离病毒制备的免疫血清。所用抗原都是和血清相应的同株抗原。每个抗原均必须准确调至四个单位，实验必须在同一条件下进行。
根据公式计算抗原比：R=√r1·r2
