r1=甲血清对乙抗原的血抑滴度/甲血清对甲抗原的血抑滴度
r2=乙血清对甲抗原的血抑滴度/乙血清对乙抗原的血抑滴度
R为抗原比，当R=1时，表明两株间抗原性相同；R＜1.5/1或1/＜1.5时，表明两毒株间抗原性无明显差异；R为1/1.5—1/2时表明两毒株的抗原性有小差异，R值越大，差异越大。
附录D 神经氨酸酶活性抑制试验
（资料附录）
D1 反应原理：
D1．1 自由的N－乙酰神经氨酸（N－acetylneuraminic acid）经神经氨酸酶的作用，自胎球蛋白（Fetuin）底物中释放。
D1．2 经过碘酸盐的氧化作用，将N－乙酰神经氨酸转化为β－甲酰丙酮酸（β－formyl pyruvic acid） 。
D1．3 β－甲酰丙酮酸经硫代巴比妥酸的作用形成生色团。
D1．4 用有机溶剂提取生色团，便可用分光光度计测定之，这样可测知标本中神经氨酸酶活性，并可选择用于神经氨酸酶抑制试验的标准剂量。
神经氨酸酶活性抑制实验是测定血清抑制标准量酶活性的效价。
NI测定已成为流感病毒鉴定不可缺少的手段之一。因NI测定结果是流感病毒神经氨酸亚型划分的主要依据之一。有时该法也用于了解流感病毒NA抗原性变异和血清诊断等方面。NI测定不受血清中非特异性抑制素的影响，但易受病毒粒血凝素抗体的影响即空间干扰。为解决这弊端，在流感病毒鉴定中，常使用单价血清（只针对NA的）或基因重配毒株所制备的免疫血清（如使基因重配株NA抗原为N2或N1，其HA抗原为马1（H7）亚型的）。
D2 材料
D2．1 试剂配制
D2．1．1 磷酸缓冲液
甲液：400mmol/L 正磷酸氢二钠
乙液：400mmol/L 正磷酸二氢钠
丙液：60mmol/L 氯化钙
甲液19ml加乙液81ml混之，将pH调至5.9±0.05，pH偏高用乙液调之，偏低用甲液调之。而后加入1ml丙液，此时CaCl2的终浓度为6mmol/L。置4℃或室温保存。
注：常常加入CaCl2后，缓冲液出现沉淀，故我们一般不加它。甲、乙液为200mmol/L。
D2．1．2 胎球蛋白
用蒸馏水把冰冻干燥的胎球蛋白配制成48－50mg/ml的溶液（让其缓慢溶解）。或将冰冻保存的胎球蛋白溶液用去离子水配成工作液。
D2．1．3 过碘酸盐试剂
4．28g过碘酸钠(NaIO4)溶于38ml去离子水中，加62ml浓正磷酸，充分混合，存于带玻璃塞的棕色瓶中。
D2．1．4 砷试剂
10g亚砷酸钠（NaAsO4）和7.1g无水硫酸钠加去离子水至100ml，混之，加0.3ml浓硫酸，使之完全溶解。
D2．1．5 硫代巴比妥酸试剂
1.2g硫代巴比妥酸和14.2g无水硫酸钠加入去离子水至200ml，在沸水浴中加热溶解，用前新配，使用期为一周。
D2．1．6 生理盐水
0.85gNaCl加入100ml去离子水，溶解，置室温保存。
D2．1．7 酸化正丁醇试剂
95ml正丁醇（Butanol）中加入5ml浓盐酸，存在带塞棕色瓶中置室温保存。
D2．1．8 玻璃器材和煮锅等。
D3 操作步骤
D3．1 神经氨酸酶活性测定
D3．1．1 病毒溶液用生理盐水作倍比稀释，一般新鲜尿囊液抗原作1：2—1：32稀释已足够。稀释好的病毒，每个稀释度加一管，0.05ml/管。于底物对照管中加入0.05ml生理盐水(不加病毒)。
D3．1．2 于每管中加入0.05mlpH5.9的PBS(因流感病毒神经氨酸酶最适pH为5.9)，每管中再加入0.1ml胎蛋白溶液，充分混合后置37℃水浴16－18h。
注：加每样试剂均应送至管底；我们稀释病毒有时直接用200mmol/L pH5.9的PBS，每管加0.1ml，这样做不正规，但操作方便，对测定结果影响不大；有些流感病毒株NA活性很高，于37℃水浴2－4h(与底物一起)就可测出酶活性。
D3．1．3 从水浴中取出试管，放室温冷却，每管加入0.1ml过碘酸盐试剂，充分混合，置室温20min（这个时间要精确）。
D3．1．4 每管缓慢加入1ml砷试剂。由于碘的释放出现棕色，摇荡试管待棕色消失乳白色出现为止。必要时试验可在此步暂停，测定物置4℃冰箱保存。其余测定步骤一律不能暂停）。
D3．1．5 每管加入2.5ml硫代巴比妥酸试剂，充分混合。该试剂在煮沸溶解时趁热加入管中。
D3．1．6 立刻将试管置煮沸的水浴中煮15min，此时所出现的红色即为神经氨酸酶活性的反应。
D3．1．7 将试管置冰水中冷却，然后加入4ml酸化正丁醇，塞上干净的胶皮塞，用手剧烈摇荡1－2min，使红色转到丁醇层。
D3．1．8 1500r/min离心5min，上层达到透明不混浊。
D3．1．9 将分光光度计波长调至549nm，用底物对照管调零点，而后，从高稀释度到低稀释度，将管中的上层溶液吸置透光池中，依次测出并记录它们的吸光度A值（曾称光密度OD值），A值越高表明酶活性越强。
D3．1．10 一个酶单位确定：一般将A值为0.45－0.85的病毒稀释度作为一个酶单位。我们常将A值为0.5的病毒稀释度为一个酶单位，用于酶活性抑制测定。一个酶单位确定方法如下：将上述测到的数据作直线回归，找出A值为0.5的病毒稀释度。但也可以下方法来确定：
（1）取一张半对数坐标纸，其纵轴（对数）表示病毒的稀释度，横轴（算术）表示吸光度。于吸光度值为0.5处画一条与纵轴平行的直线。
（2）将所得的A值一一标在相应的位置上，见图1示意图。
（3）在吸光值0.5附近找出4个点，其中2个点A值大于0.5，而另2个点小于0.5。在这4个点中找出一条直线，这条直线要使它一侧点至其垂直线的平均值与另一侧点到其垂直线的平均值相等。这条线与0.5的垂直线有一个交叉点（图中X点）。
（4）从X点向纵轴线划一条与横坐标相平行的线（图中虚线），这条线与纵坐标相交的点为Y。
（5）Y点所示的数字如8，也就是说当测定病毒1：8稀释时就相当于一个酶单位。
注：由于病毒鉴定时多为定性，一般做到步骤6（D3.1.6）已足够，接着可凭经验判断病毒所用的浓度；有些流感病毒株酶活性很低，经延长与底物孵育时间后仍很低，对这些毒株进行酶鉴定时，需灵活掌握，一般肉眼见到有一定的红色（吸光度肯定小于0.5）也就可以了。
D3．2 神经氨酸酶活性抑制测定
D3．2．1 测定血清作0.5Lg稀释（一个0.5Lg稀释为1：3.16，它的近似值为1：3.2）。具体稀释法举例如图2。稀释好的血清从高稀释度到低稀释度各取出0.05ml于标好相应稀释度的空管中.按同法做正常血清对照组。
D3．2．2 将已测定的抗原用生理盐水配成一个酶单位，加入测定血清和对照血清中，0.05ml/管。相混，37℃水浴孵育1h。
D3．2．3 从水浴中取出试管，每管加入0.1ml胎球蛋白溶液，混合，置37℃水浴16－18h。
D3．2．4 从水浴取出，接着步骤同酶测定步骤3－9（D3.1.3－D3.1.9）。但吸上层溶液于透光池中，应从低稀释度血清到高稀释度血清。
D3．2．5 计算血清对神经氨酸酶活性抑制效价：根据测定血清与正常血清两组的测定结果，求每组血清同一稀释度A值的商数，即为经血清作用后所剩的酶活性百分数。具体计算公式如下：
每一稀释度（如1：10）血清+病毒的A值
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－×100%=%酶活性
同一稀释度（1：10）正常血清+病毒的A值
D3．2．6 血清效价是能抑制50%酶活性的最高血清稀释度的倒数。它的确定方法如下：
（1）取一张半对数坐标纸，纵坐标（对数）表示血清稀释度，横坐标（算术）表示剩下神经氨酸酶活性的百分数。
（2）将“5”步骤（D3.2.5）所得的数放在坐标纸上应在的位置。如图3（略）。
（3）从酶活性剩余50%处划一条与纵坐标平行的直线，在50%酶活性处找出3－4个点，使其中1－2个点剩余酶活性不到50%，而其他1－2个点剩余酶活性大于50%，在这3－4个点间画一条直线，同样使这条直线一侧的1－2点至直线垂直线的平均值与另一侧的垂直线平均值相等。
（4）从这条线与50%线相交处（途中x）向纵坐标划一条与横坐标相平行线。这条线与纵坐标相交叉（y）处所表示的数字即为血清效价。如y处为1400，则该血清神经氨酸酶抑制效价为1：1400。当然也可用直线回归来计算。
注：对流感病毒株鉴定时，我们对阳性血清常用200mmol/L pH5.9的PBS进行倍比稀释，一般从1：10开始，用量0.1ml/管，这样加上0.1ml抗原在加0.1ml底物，这时总量为0.3ml/管，与标准的0.2ml/管有出入，但对定性测定影响不大；正常对照血清用不同亚型或不同型免疫血清替代；结果常用肉眼判断，不测A值；至于血凝素抗体空间干扰问题，一般情况不加以重视，因它的干扰程度约为10%，我们所用的免疫血清血抑效价多为1：640左右，这样当NI效价≥40时可判为阳性，一般就不受空间干扰影响了；当然对关键重要毒株鉴定时，需用单价的抗血清进行鉴定；在磷酸缓冲液中需加入终浓度为1‰的NaN3；Russ 等人曾报道用三硝基甲苯X－100（TritonX－100），Yamane等人报道用多聚仙梨醇（Nonidet P40）直接处理完整的病毒粒，就能排除空间干扰，根据我们的实践，这些方法效果不稳定。
附录E 对流免疫电泳及琼脂凝胶沉淀试验
（资料附录）
E1 对流免疫电泳 （Counter－Immunoelectrophoresis）
E1．1 原理
带电颗粒向着与它相反电荷的电极移动，称为“电泳”。胶体颗粒由于解离或吸附而使表面带电荷，在电场中便发生移动。例如蛋白质由于有暴露在表面的极化基团，如－COO－基和NH3+，在酸性溶液里－COO－基和H+结合，生成不解离的－COOH，结果蛋白质分子表面的NH3+基过剩，使它带有正电荷；反之，在碱性溶液里，－OH－与－NH3+基作用生成H2O和不带电荷的－NH2基，结果，分子因－COO－基过剩而带负电荷。反应式如下（略）：
在某一特定pH时，蛋白质分子净电荷为零，这时的pH为该蛋白的等电点。在等电点的pH溶液中，蛋白质分子既不向正极也不向负极移动。根据胶体的此种特性，给一个高于或低于蛋白质等电点的pH溶液，在一定的电场影响下会使颗粒向一极移动。
在pH 8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白只带有微弱的负电荷，它的分子较大，电泳慢，受电渗作用的影响，电泳时向负极倒退。抗原蛋白有较强的负电荷，分子较小，泳动快，在电渗作用下，虽然减慢了泳动的速度，但仍向正极泳动。如将抗体置正极，抗原置负极，电泳时，抗体和抗原相对泳动，一定时间后在两极之间相遇，在适当的地方就形成肉眼可见的沉淀线。
E1．2 主要材料
E1．2．1 甲、乙型流感病毒NP抗原和相应的抗血清。
E1．2．2 pH 8.6巴比妥缓冲液
9g巴比妥纳加0.5gNaN3，用去离子水配至1000ml，而后用盐酸将pH调至8.6。
E1．2．3 1.5%琼脂糖
1.5g琼脂糖加50mlpH8.6巴比妥缓冲液，用去离子水补至100ml，相混，溶解。
E1．2．4 玻璃板或特制的电泳框架。
将溶化的琼脂糖倒在玻璃板或框架上，琼脂厚度为2－3mm。
E1．2．5 染色液
0.5g考马斯亮兰溶于100ml去离子水中。但一般不需要染色。
E1．3 操作步骤
E1．3．1 待琼脂糖凝固结实后，打数排小孔，横纵向孔距均为6mm，孔直径为4mm。
E1．3．2 放电泳液
把打好孔的板放入电泳槽中，然后放入电泳液（pH8.6巴比妥缓冲液）。但电泳液不能把琼脂淹没。
E1．3．3 搭桥
玻璃板两头（正、负极）用普通滤纸搭成桥，使电泳时电流从琼脂糖通用。
E1．3．4 加样
见下面示意图（略）。
E1．3．5 电泳
一般用低压输出，2mA/cm，电泳1－2h。
E1．3．6 结果观察
首先观察对照样本。A与A，B与B孔间应见清晰的一条白色沉淀线，A与B及B与A孔间见不到白色沉淀线；如果测定抗原与A抗体孔间出现一条白色沉淀线，就判断测定抗原为甲型流感病毒；如果测定抗原与B抗体间出现一条白色沉淀线，则断定测定抗原为乙型流感病毒。
注：有时电泳后，沉淀线不够清晰，可将琼脂板泡在生理盐水中2－4h；也可将盐水泡过的琼脂板放入考马斯亮兰溶液中染1h，取出再泡在盐水中，这样能提高沉淀线的清晰度。用盐水浸泡过的沉淀线为白色，而经考马斯亮兰染色过沉淀线为兰色。经染色后仍见不到沉淀线，可判定测定抗原既不是甲型，也不是乙型流感病毒。
E2 琼脂凝胶沉淀试验
琼脂凝胶沉淀（Agar Gel Precipitation，AGP）试验是根据在琼脂介质中抗原和抗体同时向着相互方向移动所形成的沉淀线。所有流感病毒核壳蛋白（NP）和基质蛋白（MP）的抗原性均具有型的特异性。AGP试验就是用来测定上述两种抗体或抗原。而当前主要用于禽血清中的抗体测定。
当今已发现的甲型流感病毒，其血凝素有15个亚型，神经氨酸酶有9个亚型，它们均能在禽中找到，如果用HI或NI法（具有亚型特异的）进行血清学调查，几乎不可能，因工作量很大。众所周知，禽流感实际上为一种人、禽、畜共患病，禽中的流感动态已越来越被人们所重视。
以往认为禽血清的抗体用琼脂凝胶沉淀测定时，不易出现沉淀线。近来发现，如在高盐条件下，可出现清晰的沉淀线。
E2．1 安全
操作酚时戴上手套和面罩，用过的装置和电极用冷水冲洗；如果接触到酚，马上洗手，接触部位立即用冷水冲洗。
E2．2 实验材料
E2．2．1 琼脂扩散板配制：
氯化钠 80g
酚 5g
去离子水 1000ml
琼脂 12.5g
